SEPSOT-CODE

La sepsi è ancora una delle principali cause di morbilità e mortalità nei riceventi di trapianto di organi solidi (SOT). Non esiste uno standard d’oro nella definizione della sepsi a causa della complessità della malattia. Dopo le prime linee guida della Surviving Sepsis Campaign nel 2004, sono state effettuate diverse revisioni per migliorare i risultati con nuove raccomandazioni combinando marcatori fisiologici e di laboratorio non specifici. Non esiste ancora un metodo perfetto per discriminare tra sepsi e non sepsi. Punteggi di screening per sepsi o shock settico come SOFA (Status of Forces Agreement), NEWS (National Early Warning Score) e MEWS (Modified Early Warning Score) non sono raccomandati come unico strumento di screening per sepsi o shock settico, specialmente nei pazienti SOT.

Il rischio di infezioni gravi nei riceventi SOT è determinato dalle interazioni tra le esposizioni epidemiologiche del paziente e lo stato netto di immunosoppressione. Inoltre, nei SOT c’è una significativa incidenza di tossicità da farmaci e rischio di interazioni farmacologiche con agenti immunosoppressori usati per preservare la funzione del trapianto, che complicano notevolmente l’interpretazione del quadro clinico. Tuttavia, la diagnosi rapida e il trattamento appropriato della sepsi sono cruciali per migliorare il risultato di sopravvivenza in questa popolazione speciale. Purtroppo, l’identificazione della sepsi è una sfida nei SOT a causa del compromesso della classica risposta infiammatoria sistemica solitamente osservata nei pazienti immunocompetenti e delle difficoltà nella diagnosi precoce e differenziale. Inoltre, negli ultimi anni, è stato osservato un progressivo e allarmante aumento delle infezioni causate da ceppi multiresistenti (MDR) nella popolazione SOT a livello mondiale, specialmente in Italia, associato a un aumentato rischio di morbilità e mortalità a causa del ritardo nell’inizio di un trattamento antibiotico efficace.

Nel periodo iniziale dopo il trapianto, le infezioni possono derivare da complicazioni chirurgiche, infezioni derivate dal donatore (DDI), infezioni preesistenti nel ricevente e infezioni nosocomiali. In questo periodo specifico, le infezioni sono spesso molto gravi a causa del maggior carico di immunosoppressione e del maggior rischio di patogeni MDR. In particolare, l’uso di organi donatori che possono essere infettati da organismi MDR è una preoccupazione significativa, poiché le DDI sostenute da questi batteri sono solitamente associate a risultati scadenti.

Per minimizzare i ritardi nella diagnosi di DDI e sepsi nei riceventi SOT, è essenziale adottare tecniche diagnostiche adeguate per il riconoscimento di questa entità e la somministrazione aggressiva di antibiotici appropriati per migliorare i risultati. I metodi di laboratorio attualmente impiegati per la diagnosi di sepsi si basano principalmente su biomarcatori del sangue di base e test microbiologici standard. I biomarcatori dell’ospite, che comunemente includono il conteggio dei globuli bianchi, la proteina C-reattiva (CRP) e la procalcitonina (PCT), hanno dimostrato vari livelli di efficacia nella guida all’uso degli antibiotici. Tuttavia, l’utilità dei biomarcatori dell’ospite attualmente disponibili nel distinguere tra pazienti con e senza infezione, e quindi nel guidare l’inizio degli antibiotici, rimane bassa e con informazioni molto scarse nel contesto SOT. Data la complessità biologica della sepsi nei riceventi SOT, una strategia di stratificazione basata su un pannello di più biomarcatori potrebbe avere più potenziale per soddisfare le esigenze di uno strumento di stratificazione basato su biomarcatori ideale e per migliorare la pratica clinica. La diagnosi microbiologica della sepsi si basa principalmente su emocolture convenzionali, che rimangono lo standard d’oro. Tuttavia, questo metodo richiede tempo e può generare risultati falsi negativi, soprattutto in caso di precedenti somministrazioni di antibiotici o quando sono coinvolti microrganismi difficili da coltivare. Rispetto ai metodi convenzionali, gli approcci molecolari non basati sulla coltura possono superare alcuni di questi svantaggi e, sebbene presentino diverse sfide tecniche e interpretative nuove, possono rappresentare una strategia promettente per affrontare la sepsi correlata ai SOT.

Sotto questa prospettiva, il consorzio SEPSOT-CODE include sia partner privati che pubblici con un’esperienza estremamente elevata nella gestione clinica delle complicazioni infettive nel contesto SOT, nella loro diagnosi microbiologica e nello sviluppo di nuovi algoritmi diagnostici. Il consorzio include cinque tra i principali centri SOT italiani:

• ASST Grande Ospedale Metropolitano Niguarda a Milano (GOMNi-MI) e Ospedale di Circolo-Fondazione Macchi a Varese (UnIns-VA), entrambi situati nel Nord-Ovest dell’Italia;
• Azienda Ospedaliero-Universitaria Pisana a Pisa (AOU-PI) nel Centro;
• Azienda Ospedaliera di Rilievo Nazionale “Antonio Cardarelli” a Napoli (AOCar-NA) e Azienda Ospedaliera Universitaria OO.RR. San Giovanni di Dio Ruggi d’Aragona a Salerno (UniSA), entrambe nel Sud del Paese.

È importante notare che l’Unità di Malattie Infettive di UnIns-VA è già il centro di riferimento nazionale per la “seconda opinione” per la definizione del rischio infettivo correlato ai SOT nella rete del Centro Nazionale Trapianti (CNT).

L’obiettivo principale dello studio proposto è creare il primo nucleo di un database interattivo basato su intelligenza artificiale (AI) e un algoritmo predittivo per l’identificazione precoce della sepsi nei pazienti SOT utilizzando dataset clinici, immunologici e microbiologici. Verrà creato un database collettivo di tutti i dataset prodotti durante lo studio e analizzato da pipeline bioinformatiche e di machine learning (ML) all’avanguardia attraverso calcolo ad alte prestazioni (HPC) presso l’Università di Trieste (UniTS), un altro partner chiave del consorzio situato nel Nord-Est del Paese e caratterizzato da una forte competenza in metagenomica, biostatistica e bioinformatica.

In sintesi, dal punto di vista del laboratorio, i pazienti SOT con sospetta sepsi saranno seguiti utilizzando parametri clinici e di laboratorio convenzionali e con un test microbiologico molecolare diretto da sangue marcato CE-IVD commercializzato da Alpha IVD S.p.A. (Alpha), il principale partner privato del consorzio. Verrà inoltre eseguito un protocollo di Next-Generation Sequencing diretto basato su 16S/18S su sangue intero insieme a un ampio pannello di marcatori immunologici. Gli stessi marcatori saranno utilizzati anche nello screening infettivo di tutti i donatori. Tutti i test microbiologici e immunologici non convenzionali saranno eseguiti nei tre hub microbiologici del consorzio: UnIns-VA per il Nord, AOU-PI per il Centro, UniSA e il Centro di Ricerca Genomica per la Salute (CRGS) per il Sud. Una panoramica generale del progetto proposto è illustrata nella Figura 1.

L’uso di test molecolari diretti da sangue per la diagnosi di infezioni del sangue proposto in questo studio è pienamente coerente con uno dei punti principali della Chiamata Aperta per la Ricerca del Nodo 3 del Bando INF-ACT Cascade. In generale, i nuovi test molecolari che utilizzano sangue intero come campione e non richiedono una coltura positiva del sangue, hanno un grande potenziale per ridurre il tempo di risposta (TAT), l’implementazione della terapia mirata, la de-escalation parallela della terapia empirica e la durata del ricovero, anche in aree critiche. Tuttavia, allo stesso tempo, in un sistema sanitario con risorse limitate, il loro uso deve essere mirato a contesti di alta probabilità pre-test per massimizzare l’efficacia e ai centri diagnostici che hanno un alto livello di competenza nel settore molecolare. Questi sistemi dovrebbero essere progettati per essere semplici da eseguire, con un breve tempo di gestione e un TAT non superiore a 4-5 ore. Inoltre, oltre al loro costo e a diverse questioni tecniche legate al loro uso su sangue intero che impattano sulla sensibilità, altre potenziali limitazioni di questi test sono il numero spesso limitato di patogeni inclusi nel pannello, nonché la mancanza o il numero limitato di marcatori di resistenza agli antibiotici. Infine, e cosa importante, un altro punto chiave legato all’uso di questi test è la corretta interpretazione del loro output, che è spesso complessa e non facilmente correlata al quadro clinico. Questo è il motivo per cui il vero punto di svolta per uno qualsiasi di questi test è la loro validazione clinica, ancor meglio se in un contesto clinico ben definito in combinazione con tutti gli altri parametri clinici e di laboratorio disponibili.

Il test molecolare commerciale CE-IVD proposto per questo studio (Bosphore® Sepsis Panel Bundle Kit) è stato sviluppato attraverso versioni successive dal 2018 da Anatolia Geneworks (www.anatoliageneworks.com), una società fondata nel 2010 a Istanbul, Turchia. Il kit identifica indipendentemente 32 patogeni tra batteri Gram-positivi e Gram-negativi e funghi, oltre a dieci diversi geni di resistenza agli antibiotici, tra quelli più frequentemente correlati alla sepsi (Figura 2). Il processo di estrazione è completamente automatizzato direttamente dal tubo primario (1 ml di sangue intero) utilizzando un manipolatore liquido modificato Hamilton STARlet® (Hamilton Company, Reno, NV, USA) con un TAT, inclusa l’amplificazione, di meno di quattro ore. Un software dedicato interpreta automaticamente i risultati producendo un report finale. Il sistema proposto ha la capacità di elaborare sei campioni per sessione, con un flusso di lavoro che può garantire fino a 24 risultati in otto ore lavorative (Figura 3). La valutazione delle prestazioni del Bosphore® Sepsis Panel Bundle Kit è stata condotta in conformità alla Decisione della Commissione del 3 febbraio 2009 sulle Specifiche Tecniche Comuni per i Dispositivi Medici Diagnostici in Vitro (2009/108/CE). Il test ha mostrato una sensibilità soddisfacente quando eseguito su campioni di sangue umano spiked con diverse specie di batteri o funghi, rilevando cariche batteriche di 50-100 unità formanti colonie per la maggior parte delle specie e leggermente superiori per i funghi inclusi nel pannello. Il processo di validazione necessario per ottenere il marchio CE-IVD si basa solo su parametri ottenuti in vitro (cioè sensibilità, specificità, riproducibilità), senza necessità di validazione clinica in un contesto reale per confermare quanto osservato. Di conseguenza, un test diagnostico marcato CE-IVD manca anche di un’indicazione chiara e solida delle categorie di pazienti che possono maggiormente beneficiarne, sperando di confermare quanto osservato durante la validazione iniziale basata in vitro. Un altro punto importante da affrontare quando si utilizza un test molecolare è capire come integrarlo – con i suoi pro e contro – con tutti gli altri parametri clinici e di laboratorio disponibili e come il loro uso combinato possa influire sulla gestione di una determinata categoria di pazienti. Questo è il motivo per cui in questa proposta di studio il test molecolare commerciale diretto da sangue sarà integrato da un approccio NGS diretto da sangue mirato 16S/18S che, anche se non marcato CE-IVD, può supportare il test commerciale in diversi dei suoi limiti, iniziando per esempio con l’identificazione di microrganismi non inclusi nel pannello commerciale. A tal fine, sono stati descritti diversi approcci nella letteratura, ma verrà seguito un protocollo comune già tecnicamente validato nel consorzio. Anche in questo caso, il test molecolare NGS non convenzionale sarà eseguito nell’hub microbiologico di ciascuna area.

Inoltre, per massimizzare l’impatto clinico di quanto osservato, verrà valutato un ampio pannello di marcatori immunologici tra i test non convenzionali. Come discusso sopra, diversi marcatori immunologici sono stati testati nei pazienti settici con prestazioni non completamente soddisfacenti, a causa di diversi fattori. Nella risposta dinamica del sistema immunitario innato all’attivazione della sepsi, si scatena una sinfonia di mediatori pro-infiammatori e anti-infiammatori, comprendente il fattore di necrosi tumorale-α (TNF-α), l’interleuchina-1β (IL-1β), l’interleuchina-6 (IL-6) e la proteina chemiotattica dei monociti 1 (MCP-1). Questo è accompagnato da un aumento delle proteine di fase acuta come PCT, calprotectina, pentraxina-3 e CRP, tra quelle che hanno trovato la loro strada nelle cliniche. Tuttavia, stanno emergendo diversi altri potenziali marcatori e, con il loro uso e la loro validazione clinica, il progetto SEPSOT-CODE mira a sviluppare un pannello immunologico olistico da utilizzare, insieme ad altri parametri clinici e di laboratorio, nella definizione del rischio e nella diagnosi di sepsi nei pazienti SOT. Tra i marcatori inclusi, il recettore solubile espresso sulle cellule mieloidi-1 (sTREM-1), il recettore solubile dell’attivatore del plasminogeno urochinasi (suPAR) e la proadrenomedullina (proADM) sono tra i più promettenti.

sTREM-1 è un membro della superfamiglia delle immunoglobuline espresso sulla superficie dei neutrofili e dei monociti, e viene sovraregolato durante le infezioni batteriche e fungine. Può identificare la sepsi nel corso di una risposta infiammatoria sistemica con alta sensibilità e specificità, confermando l’origine infettiva del quadro clinico. Gli studi hanno anche riscontrato che livelli più alti e sostenuti di sTREM-1 sono associati alla morte correlata alla sepsi.

suPAR è presente su varie cellule immunitarie come neutrofili, linfociti, monociti e macrofagi, oltre che sulle cellule endoteliali. Gioca un ruolo in numerose funzioni immunologiche tra cui la migrazione cellulare, l’adesione cellulare, l’angiogenesi, la fibrinolisi e la proliferazione cellulare. Livelli elevati di suPAR nel siero sono collegati a una maggiore mortalità. Sebbene inizialmente i livelli di suPAR fossero considerati di valore diagnostico limitato, una recente meta-analisi ha mostrato che l’area sotto la curva (AUC) di suPAR per la previsione della sepsi è alta, raggiungendo 0,83.

Infine, proADM è un biomarcatore per la sepsi derivato dall’adrenomedullina (ADM). ADM svolge un ruolo nel preservare l’integrità e la stabilità dell’endotelio dopo un’infezione grave.

Oltre a ciò, un ruolo diagnostico e prognostico importante potrebbe essere svolto dal presepsin (pSEP) il cui ruolo fisiologico, sebbene non completamente chiarito, sembra essere associato alla fagocitosi e alla successiva degradazione lisosomiale dei batteri. Durante la sepsi, i livelli di presepsin nel siero aumentano prima di quelli della procalcitonina o dell’IL-6, indicando il suo potenziale come biomarcatore per la diagnosi di sepsi. Ad esempio, i livelli aumentano significativamente dopo l’infezione del paziente rispetto ai pazienti non infetti, con l’area sotto la curva (AUC) del presepsin per prevedere una diagnosi di sepsi che supera quella della procalcitonina, dell’IL-6 o della CRP ad alta sensibilità. Inoltre, sono state segnalate notevoli differenze nei livelli di presepsin tra infezioni batteriche Gram-positive e Gram-negative. Sebbene molti studi abbiano confermato il valore diagnostico del presepsin, il suo valore prognostico rimane un argomento di dibattito. Tuttavia, un recente studio prospettico ha rivelato una correlazione tra i livelli sierici di presepsin e il rapporto di clearance del presepsin nei pazienti con sepsi grave e il punteggio SOFA, suggerendo potenziali capacità prognostiche.

Un altro interessante biomarcatore predittivo della sepsi è proADM. Agisce direttamente sul sistema nervoso simpatico, causando vasodilatazione arteriosa e venosa, natriuresi, broncodilatazione e inotropia positiva. proADM è un composto più stabile rispetto all’ADM e riflette accuratamente i livelli di ADM. Gli studi hanno dimostrato che proADM è un biomarcatore promettente per la diagnosi di sepsi ed è risultato utile nel differenziare la sepsi con coltura negativa e positiva all’ammissione in pronto soccorso. Tuttavia, sono necessarie ulteriori ricerche per valutare il valore diagnostico e prognostico di MR-proADM rispetto ad altri biomarcatori.

Altri marcatori immunologici ancora controversi che saranno inclusi nel pannello SEPSOT-CODE sono interleuchina-6 (IL-6), IL-1Ra, IL-17A, CCL19, CX3CL1, TNF-alfa, Serum Amyloid A e lattato.

L’UniTS istituirà un database curato collettivo (ccDB) per comprendere i diversi dataset prodotti per il progetto SEPSOT-CODE, spaziando tra ambiti clinici, immunologici e microbiologici. Questo ampio archivio servirà come pietra angolare per indagini rivoluzionarie, meticolosamente progettate per catturare la natura sfaccettata del rischio di sepsi. Particolare attenzione sarà dedicata alla creazione e gestione dei dataset derivati da: i) il kit commerciale CE-IVD Bosphore® Sepsis Panel Bundle Kit; ii) le tecnologie avanzate di Next-Generation Sequencing (NGS), focalizzate sia sulle regioni 16S che 18S per un’esplorazione completa della diversità microbica procariotica ed eucariotica. L’unione forgiata di questi due dataset, che non è solitamente impiegata a fondo nei test molecolari attuali nei laboratori clinici, sarà la forza di questa fase del progetto SEPSOT-CODE, adatta alla valutazione delle prestazioni successive tramite algoritmi all’avanguardia.

L’approccio NGS diretto da sangue mirato 16S/18S, ottimizzato da UniTS e impiegato da UnIns-VA, AOU-PI e UniSA/CRGS, ha la capacità aggiuntiva di elaborare centinaia di campioni per singola esecuzione (a seconda della piattaforma utilizzata), con un tempo di risposta (TAT) per il flusso di lavoro combinato di estrazione automatizzata del DNA/sequenziamento NGS inferiore a 48 ore. Il flusso di lavoro automatizzato garantirà una manipolazione umana minima, naturalmente soggetta a errori, aggiungendo oltre il 20% di varianza nei risultati finali. Il database ccDB quindi seguirà una pipeline dedicata per l’analisi dei dati composta da tre fasi già stabilite presso l’unità UniTS: gestione e archiviazione dei dati (DSM); scoperta di biomarcatori e target (BTD); analisi e visualizzazione dei dati complessi (AVCD). Il database ccDB sarà depositato presso UniTS DSM (>256 TB, >88 core) con un backup a doppio recupero, per preservare l’integrità e l’affidabilità dei dati. Un’ottimizzazione continua dell’inventario dei dati garantirà una gestione adeguata per una maggiore robustezza dei dati.

Per sfruttare il vasto potenziale di questi dataset, verranno impiegate pipeline bioinformatiche avanzate e di machine learning (ML), facilitate da un calcolo ad alte prestazioni parallelizzato (HPC) presente presso UniTS e AREA Science Park, tramite un BTD validato. L’integrazione dei dati NGS, in particolare dalle regioni 16S e 18S, fornirà una comprensione granulare della composizione microbica, aprendo la strada a correlazioni perspicaci tra profili microbiologici e risposte immunologiche. L’inclusione strategica di una coorte di scoperta negli ultimi sei mesi del progetto amplifica ulteriormente la profondità dell’analisi, garantendo risultati robusti e generalizzabili. In tandem con la creazione e l’analisi del ccDB, l’unità UniTS sfrutterà modelli di intelligenza artificiale (AI) e machine learning (ML) per prevedere e interpretare schemi complessi all’interno dei dataset, focalizzandosi soprattutto sul confronto tra il kit commerciale e i risultati NGS (curve ROC, punteggi F1). Tecniche ML avanzate, come Random Forest, PLSDA-VIP, Gradient Boosting, SIRUS, insieme a TensorFlow AI e apprendimento per rinforzo, saranno impiegate per sviluppare modelli predittivi (regressione bayesiana, CNN, mediazione, HMM) su misura per discernere indicatori sottili della presenza di sepsi nel sangue. Questi modelli mirano non solo a identificare la presenza di sepsi ma anche a fornire approfondimenti sfumati sulla sua progressione e gravità, facilitando interventi precoci e mirati. I risultati misurabili della ricerca saranno strettamente legati all’applicazione di questi modelli AI in scenari clinici, sia per i donatori di organi che per i riceventi.

In particolare, un risultato primario sarà un numero maggiore di specie microbiche (batteri e funghi) impiegabili nella fase BTD, rispetto ai 32 patogeni più 10 geni di resistenza antimicrobica (AMR) del kit molecolare commerciale CE-IVD proposto, sia nello screening dei donatori che nella diagnosi di sepsi nei riceventi SOT. Il secondo risultato sarà un database su misura di geni AMR inferiti dai dataset 16S e 18S, anch’esso impiegabile nella fase BTD. Inoltre, il progetto SEPSOT-CODE stabilirà, come terzo risultato, un’interfaccia user-friendly (Dash) che integri senza problemi questi modelli predittivi nel flusso di lavoro clinico, compatibile con kit molecolari validati. Degno di nota, SEPSOT-CODE fornirà un nuovo sepsis-score come quarto risultato, al fine di equipaggiare i clinici con informazioni real-time e azionabili, migliorando la loro capacità di prendere decisioni tempestive e cost-effective e di intervenire. L’impatto tangibile di questi risultati si rifletterà in una migliore gestione della sepsi, ridotti tempi diagnostici e, in ultima analisi, migliori risultati per i pazienti.

A titolo di esemplificazione della fase AVCD, abbiamo tentato un’analisi preliminare del sequenziamento mirato 16S NGS di campioni di sangue da 30 pazienti con sepsi, abbinati a 30 controlli non settici. Anche se con pochi pazienti, è stata riscontrata una differenza significativa sia nella composizione dell’alfa- che della beta-diversità del microbiota, evidenziando una maggiore ricchezza batterica (>30 specie) e biodiversità nel sangue dei pazienti settici. Attraverso l’analisi ML (VIP e random forest) è stata trovata una firma batterica specifica della sepsi, che ha rappresentato un’AUC di 0,995, molto superiore all’AUC di suPAR. Inoltre, i geni AMR sono stati inferiti dal dataset 16S attraverso un approccio AI integrato e di rete, trovando una prevalenza (44,5%) di meccanismi di resistenza agli antibiotici per efflusso nei batteri del sangue recuperati nei pazienti settici, seguiti dall’alterazione del target antibiotico (37,22%).